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DNA測序儀注意事項

    DNA序列測定分手工測序和自動測序,手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今 dna序列分析的主流。美國pe abi公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀,其中310型是臨床檢測實驗室中使用*多的一種型號。
   1.abi prism 310基因分析儀是上等精密儀器,需專人操作、管理和維護。
   2.本實驗測序pcr反應的總體積是5μl,而且未加礦物油覆蓋,所以pcr管蓋的密封性很重要,除加完試劑后蓋緊pcr管蓋外,*好選用pe公司的pcr管。如pcr結束后pcr液小于4~4.5μl,則此pcr反應可能失敗,不必進行純化和上樣。
   3.作為測序用戶來說,只需提供純化好的dna樣品和引物,一個測序pcr反應使用的模板不同,需要的dna量也就不同,pcr測序所需模板的量較少,一般pcr產物需30~90ng,單鏈dna需50~100ng,雙鏈dna需200~500ng,dna的純度一般是a260nm/a280nm為 1.6~2.0,*好用去離子水或三蒸水溶解dna,不用te緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
   4.本實驗使用的測序試劑盒是bigdye熒光標記終止底物循環測序試劑盒,一般可測dna長度為650bp左右。本儀器dna測序**度為 (98.5±0.5) %,儀器不能辨讀的堿基n<2%,所需測定的長度超過了650bp,則需設計另外的引物。為保證測序更為準確,可設計反向引物對同一模板進行測序,相互印證。對于n堿基可進行人工核對,有時可以辨讀出來。為提高測序的**度,根據星號提示位置,可人工分析該處彩**譜,對該處堿基作進一步核對。

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